Test Covid19 NEOKIT
Descripción del principio de acción
El método de detección de COVID-19 se basa en la retrotranscripción del genoma del SARS-CoV-2 (ARN) seguida de una amplificación molecular específica de cuatro fragmentos del ADN resultante, a partir del ARN aislado de la muestra clínica (hisopado nasofaríngeo / orofaríngeo, saliva o esputo).
La síntesis de un ADNc (retrotranscripción) seguida de la amplificación específica del fragmento (amplificación molecular isotérmica) ocurren a temperatura constante (64°C), en un único paso operativo. El resultado se revela a través de un simple cambio.
En la mezcla de reacción se encuentra presente el Azul de hidroxinaftol (Hydroxynaphthol blue - HNB), un colorante indicador que vira de color violeta a color azul cuando la reacción de amplificación es positiva. Dicho viraje, se debe al cambio de concentración del Mg2+ libre en solución conforme disminuyen los dNTPs y aumenta el pirofosfato producto de la polimerización.
Especificidad
INCLUSIVIDAD
Este kit fue desarrollado para detectar covid-19 y el diseño de sus cebadores se realizó mediante un análisis exhaustivo por comparación de las secuencias de sars-cov-2 (genbank mn908947) proveniente de wuhan, china y otras 10 secuencias más del virus obtenidas de genbank, que corresponden a china, japón y usa, que incluyen las secuencias de los virus circulantes en argentina.
Se definió el uso de cuatro juegos de cebadores (genes orf 1aa y 1ab, e y n) que presentan 100% de homología con la secuencia de los genomas evaluados de sars-cov-2.
EXCLUSIVIDAD
Se realizó un exhaustivo análisis in silico de comparación de secuencias, donde se incluyeron otros coronavirus: SARS (NC_004718.3), MERS (NC_019843.3), Bat-SARS (MG772846) y virus de diferente género: PDCoV (KX022605.1), TGEV (NC_038861.1) y PEDV(NC_003436.1). Además, se incluyeron los genomas de virus de concomitancia regional como Dengue (cuatro serotipos), Zika, Chikungunya, Influenza (H1N1), y genomas de potenciales contaminantes de la muestra, como levaduras, bacterias y humano.
A través de este estudio, se confirmó que las secuencias de los cebadores seleccionados en este kit son específicas e inequívocas para la detección de SARS-CoV-2, por lo que no se esperan reacciones cruzadas (falsos positivos) ni de interferencia (falsos negativos).
Asimismo, se realizaron ensayos de especificidad in vitro con múltiples genomas, incluyendo humano, de levaduras, bacterias y virus regionalmente concomitantes (Influenza, Dengue, Zika y Chikungunya), confirmando que el kit es específico para SARS-CoV-2.
Precisión y sensibilidad analítica
Se realizó un ensayo con una muestra de referencia de ARN purificado de SARS-CoV-2, con tres operarios en tres días diferentes. La reproducibilidad analítica (repetitividad) fue adecuada, obteniéndose con 12,5 copias de genoma viral un resultado positivo en el 100% de los casos ensayados. Con una dilución al medio, 6,25 copias de genoma viral, los estudios funcionaron bien en la mayoría de los casos (80%), conservándose la proporcionalidad con diluciones menores.
Teniendo en cuenta los resultados de sensibilidad y de repetitividad, se estableció que el límite de sensibilidad del kit es 12,5 copias del genoma viral.
El método es preciso ya que todos los resultados por encima del límite de sensibilidad definido son coincidentes en el 100% de los casos.
Interferencias
Datos experimentales y bibliográficos indican que no hay interferencias en los resultados obtenidos con el kit. Los principales contaminantes factibles de ser encontrados en las muestras, como células y ADN humano, levaduras (Saccharomyces cerevisiae) u otros microorganismos, no dan reacción cruzada con el kit.
Referencias bibliográficas:
1- Informe SARS-CoV-2 de Sociedad Argentina de Virología, División de la asociación Argentina de Microbiología, 26 de Marzo 2020 (1-31) 2-Notomi T, Okayama H, Masubuchi H, Yonekawa T, Watanabe K, Amino N, Hase T. Loop-mediated isothermal amplification of DNA. Nucleic Acids Res. 2000 Jun 15;28 (12):E63 3- World Health Organization. Coronavirus disease (COVID-19) Situation dashboard. World Health Organization website. https://who.sprinklr.com/. Accessed 17 April, 2020. 4- Goto M, Honda E, Ogura A, Nomoto A, Hanaki K (2009) Colorimetric detection of loop-mediated isothermal amplification reaction by using hydroxy naphthol blue. Biotechniques 46(3):167–172 5- Bhadra, S., Jiang, Y.S., Kumar, M.R., Johnson, R.F., Hensley, L.E., Ellington, A.D., 2015. Real-time sequence-validated loop-mediated isothermal amplification assays for detection of Middle East respiratory syndrome coronavirus (MERS-CoV). PLoS One 10, e0123126.
Preguntas frecuentes
El método de detección de COVID-19 se basa en la retrotranscripción del genoma viral del SARS-CoV-2 seguida de una amplificación molecular del ADN resultante, a partir del ARN aislado de la muestra clínica (hisopado nasofaríngeo, orofaríngeo, saliva o esputo). Ambas reacciones ocurren a temperatura constante (64⁰C) en un único paso operativo y producen un viraje de color violeta a color azul cuando la reacción de amplificación es positiva.
